86639-62-5 10-硝基喜树碱

• 背景及概述 喜树（Camptothecaacuminate Decne）为珙桐科喜树属植物，1985年，Hsing 等发现喜树碱及其衍生物是以 DN A 拓扑异构酶 I（Topo I）为作用靶标并抑制生物体 DN A的合成而发挥抗肿瘤的作用后，研究开发高效低毒的喜树碱抗肿瘤新药成为药学工作者的工作热点。喜树碱（Camptothecin，CPT）是由美国化学家Wall等从中国珙桐科植物喜树（Camptothecacuminata）皮果实中提取出来的一种活性物质，并确定结构为一种生物碱，它是一种具有抗肿瘤作用的中药有效成分。该类生物碱存在内酯型与羧酸盐型2种形式，具有内酯环结构的内酯型在碱性水溶液中皂化开环生成溶于水的羧酸盐型，在酸性条件下又重新环合成内酯型。但由于其对消化系统和泌尿 系统的不良反应，随后的10多年间，相关研究大大减少。直到1985年，Hisang 等揭示了喜树碱抑制拓扑异构酶I（TopoI）的新作用机制，又一次引起国内外医药界的极大重视。为寻找到低毒高效的喜树碱类似物，研究者们对喜树碱进行了多样的结构修饰，大量衍生物应运而生，有的已用于临床抗癌治疗，如拓扑替康（ropotee n）、伊立替康（irinoteean）。 9-硝基喜树碱（rubitecan，9-NC）是一种新型的半合成喜树碱衍生物，又称 RFS200 0，商品名为鲁比替康（rubiteean），是美国 Super Gene公司研制的半合成喜树碱衍生物，为五环结构，含有一个吡咯[3,4-b] 喹啉环（A,B,C），一个共轭的吡啶酮环（D）和一个六元α-羟基内酯环（E），A环第9位上有一个硝基。完整的α-羟基内酯环活性的必备条件，且只有20（S）构型有活性。临床前药理学研究显示该药是非常理想的抗肿瘤药物，它不仅对常见的肿瘤均有高效的抑制作用，而且与目前常用的抗肿瘤药如5-Fu有良好的协同作用，它还能抑制亚致死损害恢复可作为肿瘤放疗的增敏剂。该药还能抑制HIV病毒的复制，未来也有望用于获得性免疫缺陷综合症AIDS的治疗。
• 作用机制 喜树碱及其衍生物是以拓扑异构酶I为作用靶点，抑制DN A 的合成。拓扑异构酶I是生物体内广泛存在的一类必需酶，参与DNA复制、转录、重组和修复等所有关键的过程。Topo I为单体酶，分子量为91 ku，共含有765个氨基酸，定位于第20号染色体。Topo I主要集中在DNA 活性转录区，能使 DNA的链发生断裂和再连接。在正常的酶催化循环中，Topo I与DNA 结合，DNA 的一条链断裂，形成可裂解的复合物，从而改变DNA的连环数和超螺旋数。9-硝基喜树碱以Topo I为作用靶点，其内酯环打开，酰基与Topo I中的亲核部分相互作用，与Topo I-DN A 断裂复合物可逆结合，形成药物- Topo I- DNA三元复合物，从而稳定了可裂解复合物，使复制叉不能进行下去，从而使细胞死亡。由于癌变细胞的Topo I含量很高，所以癌变细胞比正常细胞更易受 Topo I的抑制作用。 细胞能否分裂决定于进入S期及M期这两个关键点，研究发现9-NC可以诱导细胞凋亡给药后细胞生长的S期和G2M期都推迟，9-NC在整个细胞周期内都有抑制并且发现这种抑制作用有剂量和时间依赖性。
• 药理作用 体外实验 1）抗肿瘤作用：不同浓度的 9-NC（20、40、80nmol/L）均可抑制人恶性黑素瘤细胞（MEL细胞与BRO细胞）在体外的生长。对于MEL细胞，9-NC使其细胞周期停滞在S期与G2期的交界处，不引起或仅引起少数细胞的凋亡。对于BRO细胞，9-NC使其细胞周期停滞在S 期，并可触发细胞凋亡，这种凋亡是难以撤 消的，即使停药，仍可继续进行。 用人卵巢癌SKOV-3细胞进行实验，发现9-NC可加速部分SKOV-3细胞的 凋亡，提示细胞对9-NC的敏感性存在差异；用DU145前列腺癌细胞进行实验，发现 9-NC可触发细胞凋亡的发生，且触发过程是 由CD95系统所介导的。9-NC 可使 CD95 和CD95L的表达增加，使DU145细胞从非凋亡态转变为前凋亡态，从而触发凋亡的发生。 2）放射增强作用：将 9-NC加到培养皿中对人H460肺癌细胞进行培养，之后结合放射治疗。结果显示，用l0 nmol/L 9-NC对H460细胞进行4-24h不同时间的培养，各实验组均观察到放射作用的增强，且各组间差异无显著性。另外，实验者又采用5、10、15nmol/L 9-NC对 H460细胞进行24h培养，三组的放射剂量增强率（ER）分别为1.22、1.54、2.0。 3）抗病毒作用：用已感染I型人免疫缺陷病毒（HIV-I）的U937单核细胞进行实验，结果发现9-NC可抑制病毒的复制和抑制HIV-I从被感染细胞中的释 放，且反应呈剂量依赖性。其他一些实验也证实了9-NC的抗病毒活性，如9-NC可抑制肿瘤坏死因子介导的HIV-I的激活作用，并可加速已潜在感染的T细胞凋亡；用已感染HIV-I的外周血液淋巴细胞进实验，结果同样显示 9-NC可抑制HIV-I在宿主细胞中的复制，并诱发细胞凋亡。 体内实验 1）抗肿瘤作用：在 2种癌细胞肺转移的模型中，9-NC均显示出良好的抗肿瘤活性。用 9-NC脂质体气雾剂对接种有 B16 黑素瘤细胞的小鼠进行治疗，每周1h，分5d给药。治疗3周后，小鼠肺重量减轻，肿瘤病灶数显著下降。将此结果与未治疗组比较，肉眼可见的肿瘤结节明显缩小和减少。用相同给药方案对接种有人骨肉瘤的小鼠进行治疗，8周或10周后，显微镜及肉眼观察到病灶的小鼠数量明显下降，单个肿瘤结节的体积明显减小，肺部总肿瘤病灶数也明显 降低。给接种人肺癌的小鼠肌内注射 9-NC悬浮液4mg/kg，1周2次，可显著抑制肿瘤生长，且可对肿瘤细胞的细胞周期造成明显改变，使细胞凋亡并最终被正 常组织清除出体外。给接种人乳腺癌的鼠肌内注射9-NC悬浮液4mg/kg，1周2 次，肿瘤无继续发展的趋势，可见9-NC可抑制乳腺癌肿瘤的生长。给接种人卵巢癌的小鼠肌内注射9-NC悬浮液4mg/kg，1周2次，5d后体积较小的肿瘤有50 % 受到抑制；52d后，肿瘤普遍缩小或完全除。另一组实验还显示，在给药期间较小的肿瘤被完全抑制，且在停药后的45d内，仍无再生长现象。给接种有 U-937白血病的小鼠肌内注射 9-NC悬浮液 4 mg/kg，l周2次，结果显示，9-NC可较大程度地延迟肿瘤的生长。实验者给7只小鼠移植了U-937 细胞，1d后给予 9-NC治疗，并记录肿瘤长到可测大h所需的时间。其中5 只需26d，l需40 d，1只无肿瘤生成，而未接受治疗的对照组肿瘤长成的时间只需 5-7d。用9-NC 脂质体气雾剂对接种有不同类型肿瘤（乳腺癌、结肠癌、肺癌）的小鼠进行治疗， 剂量为200μg/kg/d，l周5 次，治疗后肿瘤的生长速度大大下降，有的在治疗数 周后已完全检测不到。实验显示，当9-NC 以气雾剂的形式用于治疗时，其有效剂量比以传统给药式治疗时小。若给小鼠口服上述剂量，无任何实质作用；肌注相同剂量则只有部分疗效，且十分限。 2）放射增强作用：将接种了H460 细胞的小鼠分为3组，仅口服 9-NC组（l mg/kg）、仅接受放射治疗组和口服9-NC结合放疗组。结果表明，9-NC可增 强放射治疗的效果，其增强因子（EF）为1.64。
• 合成路线 采用混合硝化剂合成20(S)-9-硝基喜树碱。以喜树碱为原料，浓硫酸为反应介质，混合硝酸盐为硝化剂进行硝化反应，再经色谱分离提纯制得目标产物9-NC。使9-NC的收率由31%上升到40%左右。研究得到的最佳工艺条件：喜树碱0.5g，浓硫酸30ml；硝酸根0.007mol，硝酸铵和硝酸钙的摩尔比为1:1；反应温度20℃，反应时间为1天。本方法具有收率高、易分离提纯等优点，具体反应过程如下：
• 药代动力学 已知9-NC在体内转化为9-氨基喜树碱（9-AC）。通过对小鼠、犬及人的实验测定了9-NC 转化成 9-AC的药动学参数。 1）以小鼠为实验对象，单剂量口服9-NC 4.1mg /kg后Tmax为0.1h，Cmax为732ng/mL，t1/2为10.0 h，AUC为441ng/h/mL。当9-NC转化为9-AC后，9-AC 的Tmax为0.6h，Cmax为26ng/mL，t1/2为1.2 h，AUC为63ng/h/mL。 2）以犬为实验对象，单剂量口服 9-NC 1.0mg/kg后，Tmax为 0.7 h，Cmax为19.1ng/mL，t1/264h，AUC为186ng/h/mL。当9-NC转化为9-AC 后，9-AC的Tmax为2.9 h，Cmax为9.2ng/mL，t1/2为21.lh，AUC为310 ng/h/mL。 3）人体试验中单剂量口服9-NC 0.1mg/kg，Tmax为3.4 h，Cmax为483 ng/mL，AUC为2600 ng/h/mL ，t1/2为2.5h。当 9-NC转化为9-AC后，9-AC的Tmax为10.3 h，Cmax为14.0 ng/mL，AUC为3l1 ng/h/mL，t1/2为7.l h。单剂量口服9-NC 1.0mg/kg，Tmax为5.3h，达Cmax ng/mL，AUC为17194 ng/h/mL，t1/2为4.9 h。当9-NC转化为9-AC后，9-AC的Tmax为17.2 h，Cmax为208 ng/mL，AUC为9121 ng/h/mL，t1/2为13.l h。
• 药物相互作用 试验证实，9-硝基喜树碱与5-氟尿嘧啶（5-FU）在治疗肿瘤时具有协同作用。用HCT-8结肠癌细胞进行实验，9-NC与5-FU联用后，药物活性所加强。另外，实验中必须先给予9-NC，再给予5-FU，才能显示出二者的协同作用，提示给药 顺序是十分重要的。用接种有白血病 P-388细胞的小鼠进行实验，将9-NC与苯 丙氨酸氮芥（美法仑）联用，结果发现，两药合用后，抗癌活性有所增强，说明 9-NC与美法仑在治疗肿瘤时具有协同作用。
• 剂型研究 脂质体 将9-NC制成脂质体，考察其药剂学性质，并且比较游离药物与脂质体对于体外HepG2、Bel-7402、Hep3B及L02细胞的增殖与凋亡的影响，以及体内抗HCC肝癌的作用。结果显示，脂质体平均粒径在190nm，电位约-1.1mV，并且在体外稳定持续释放，并且脂质体可以提高9-NC的溶解度和稳定性，使其副作用小，在9-NC抗肿瘤的作用上更有前景。 纳米粒 用纳米沉降法将9-NC载入纳米粒中平均粒径在207±26nm，药物包封率在33.5%，药物在PBS中可以持续释放160h，静脉注射给药后发现9-NC纳米粒较9-NC游离药物可以有效提高药物在血浆中内酯型的含量及总量，内酯型及总量时间浓度曲线下面积AUC都是游离药物的3.63和5.40倍。 包合物 用羟丙基-β-环糊精为包合材料，冷冻干燥法制备9-NC包合物，使得几乎不溶的9-NC在水中的溶解度增加到0.52mg/mL，肌肉注射后包合物的AUC为632.79ng/h/ml，而游离药物为439.39 ng/h/ml，静脉注射后包合物的AUC为538.05５３ng/h/ml，而游离药物为385.39 ng/h/ml。不但如此，内酯型的比例也有所提高，这一结果提示9-NC羟丙基-β-环糊精包合物对于癌症治疗上很有前景。 自微乳 自微乳是一种新型的很有前景的给药系统，是油相表面活性剂助表面活性剂和药物的混合，主要原理是通过水相的加入，在温和的搅动下可自发形成O/W型的微乳，而人体的胃肠道的蠕动提供自发形成微乳的条件。自微乳可以增加9-NC口服吸收的生物利用度及抗肿瘤作用。有2种处方制备自微乳：一种是以油酸乙酯为油相，吐温-80为表面活性剂，PEG400为助表面活性剂,组成；还有一种是以聚氧乙烯蓖麻油替换吐温-80作为表面活性剂。体外抗肿瘤实验发现，9-NC自微乳相较于游离药物可以显著让裸鼠身上种植的人类卵巢肿瘤明显减小。 胶束 将9-NC载入与叶酸偶联的聚合胶束里，通过检测其临界胶束浓度粒径、电位、包封率等评价其处方工艺，形成的胶束所用的材料DSPE-PEG，以避免体内巨噬细胞的吞噬，达到长循环的作用，以帮助药物到达肿瘤靶部位发挥药效。
• 主要参考资料 [1] 殷琦等. 正在研究中的抗肿瘤新药9-硝基喜树碱. 中国新药杂志. 2005,14(2):226-230. [2] 胡蓉蓉等. 9-硝基喜树碱研究进展. 南京中医药大学学报.2012,28(5):498-500. [3] 郑艳等. 9-硝基喜树碱的研究进展. 化学与生物工程.200 6,23 (6):11-13. [4] 李庆勇等. 9 - 硝基喜树碱衍生物的合成及体外抗肿瘤活性. 中国药学杂志 . 2007,42(10):786-789. [5] 李践等. 20(S)-9-硝基喜树碱的合成研究. 医学研究杂志.2008,37(3):105-106. [6] 闫晶超等. 9-硝基喜树碱犬体内药代动力学研究. 中国临床药理学与治疗学. 2005 ,10 (11):1220-1223.

医药

路线1：混合硝化剂合成法

• 原料：喜树碱；浓硫酸（反应介质）；混合硝酸盐（硝酸铵和硝酸钙摩尔比1:1，0.007mol）
• 步骤：以喜树碱为原料，在浓硫酸中加入混合硝酸盐进行硝化反应
• 条件：反应温度20℃，反应时间1天
• 收率：收率由31%提升至40%左右
• 后处理：经色谱分离提纯得到目标产物