糜胰蛋白酶
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用途与制备
医药
提取将新鲜或冷冻锗胰,解冻、洗净并投入绞肉机绞碎,按照猪胰浆量加2倍量体积的硫酸溶液(0.125mol/L),搅拌均匀,搅拌下提取1h,调节PH3右左,于4 0 放置过夜。次日,用双层纱布过滤,滤渣用等体积冷硫酸溶液(0.125mol/L),重复提取1次,合并2次滤液,得提取液。 猪胰脏 H{2SO 4 ;pH3;4 0 → 提取 提取液 分段盐析在不断搅拌下,将提取液中逐渐加入工业用硫酸铵一定量,使硫酸铵的饱和度达25%。再加少量活性白陶土一定量助滤,放置低温处,1d后过滤,滤液再加硫酸铵(CP)同上操作,得复2次,收集25%~65%饱和度沉淀部分,得粗制滤饼。 提取液 (NH 4 ) 2 SO 4 → 分段盐析 粗制滤饼 透析、盐析将粗滤饼用3倍体积的冷蒸馏水溶解,在低温下对pH5.5的乙酸缓冲液(0.01mol/L)透析,过滤,在清液加硫酸铵(CP)一定量,至硫酸铵饱和度达65%,将沉淀抽滤,得透析滤饼。 粗制滤饼 pH5.5;醋酸缓冲液;(NH 4 ) 2 SO 4 → 透析;盐析 透析滤饼 盐析、除杂质将透析饼在3倍体积冷蒸馏水溶解,调节pH3~3.5,加硫酸铵(CP)一定量,至硫酸铵饱和度达25%,室温下放置3~5h后,用0.5%活性炭助滤,得澄清滤液。然后在不断搅拌下,将100ml的澄清滤液缓慢加入预热至25 0 左右的乙醇10ml(乙醇浓度达10%),在室温下放置3h后过滤,得澄清滤液。 透析滤饼 (NH 4 ) 2 SO 4 乙醇;pH3 → 盐析;去杂蛋白 滤液 盐析、透析、再盐析滤液加硫酸铵(CP)一定量,使硫酸铵达65%饱和度,盐析后过滤,得滤液。然后将硫酸在低温下对pH5.5乙酸缓冲液(0.01mol/L)透析2d,过滤除去沉淀,清液加硫酸宛如(CP)至65%饱和度,再盐析,过滤得滤饼。 滤液pH5.5;醋酸缓冲液;(NH 4 ) 2 SO 4 → 盐析;透析;再盐析 滤饼 结晶、再结晶滤饼溶于3倍体积冷蒸馏水中,用硫酸(2.5mol/L)调节pH至3,用酸洗后滑石粉助滤,在不断搅拌下,于澄清滤液的每100ml中缓慢加入33.3ml的饱和硫酸铵溶液,将浑浊过滤除去。滤液用氢氧化钠(2mol/L)调节pH至6 ,再加入一定量饱和硫酸铵溶液至似混非混程度,于25 0 C下放置,待2h后即有结晶析出,次日收集结晶,得结晶滤饼。按上述操作程序得复结晶1次,得二次结晶滤饼。 滤饼 (NH 4 ) 2 SO 4 ;pH6;25 0 → 结晶;再结晶 再结晶滤饼 透析、沉淀在结晶滤饼中加入适量的稀盐酸,使之溶解。溶解后的滤饼对pH3~3.5的冰水透析,透析液滤清后,在低温下,每100ml透析滤清液中缓慢加入95%乙醇(CP)70ML,沉淀离心、过滤,用丙酮脱水3次,真空干燥,得注射用结晶糜胰蛋白酶原料。收率4~7g/kg(猪胰)。 再结晶滤饼 冰水;乙醇;pH3 → 透析;沉淀 结晶糜胰蛋白酶 透析、沉淀在结晶母液加硫酸铵一定量,使硫酸铵至70%饱和度,过滤,滤饼同上操作,得外用糜胰蛋白酶原料。 再结晶母液 (NH 4 ) 2 SO 4 70% → 透析;沉淀 外用糜胰蛋白酶原料